CAZy数据库简介

CAZy 全称为Carbohydrate-Active enZYmes Database，碳水化合物酶相关的专业数据库，内容包括能催化碳水化合物降解、修饰、以及生物合成的相关酶系家族。其包含五个主要分类：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases, GHs）、糖基转移酶（GlycosylTransferases, GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases, PLs）、糖酯酶（Carbohydrate Esterases, CEs）和氧化还原酶（Auxiliary Activities, AAs）。此外，还包含与碳水化合物结合结构域（Carbohydrate-Binding Modules， CBMs）。五大分类和一个结构域下，都分别建立了多个Family。

GHs：糖苷键的水解和/或重排
GTs：糖苷键的形成
PLs：糖苷键的非水解裂解
CEs：水解碳水化合物的酯类
AAs：与 CAZymes 协同作用的氧化还原酶
CBMs：与碳水化合物结合

CAZy数据库的准备

在进行预测之前需要准备数据库，CAZy貌似没有提供FASTA格式的序列数据库，而仅提供了序列的Assenssion number，需要我们自己从NCBI数据库中下载序列。下载方法参照我之前的文章《根据assession number批量从NCB下载数据》，在文章中提供了下载CAZy序列的方法和脚本，此处不再赘述。

在上一篇文章结尾获得的“All.sequences.fas”文件包含了所有的CAZy数据库序列，在正式预测之前需要完成数据库的格式化。后面我们将通过Diamond软件从基因组中预测CAZy蛋白，因此采用Diamond格式化数据库。

序列预处理

不知道什么原因，下载的序列存在两个问题，其一，下一条序列的ID连接着上一条序列的末尾，没有断行；其二，序列中存在着一段网页代码。因此，需要分两步进行修正。

解决断行问题

撰写脚本“add_linebreak.pl”，内容如下：

#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
# Author: Liu hualin
# Date: Sep 30, 2021

local $/=">";
open IN, "All.sequences.fas" || die;
open OUT, ">CAZy.fas" || die;
<IN>;
while (<IN>) {
	chomp;
	print OUT ">$_\n";
}
close IN;
close OUT;

将脚本与”All.sequences.fas”放在同一目录下，在终端或者命令行中运行如下命令，得到“CAZy.fas”。

1	perl add_linebreak.pl

删除无关内容

用EmEditor软件打开CAZy.fas，Ctrl+F调出查找功能，搜索“www.” 可以看到如下内容，手动将其删除，并保存文件。

构建Diamond数据库

1	diamond makedb --in CAZy.fas -d CAZy

开始序列比对

当然，我们选择用Perl进行批量比对

#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
# Author: Liu hualin
# Date: Sep 30, 2021

my @faa = glob("*.faa");# 读取所有后缀为“.faa”的文件，可以自己更改
foreach  (@faa) {
	$_=~/(.+).faa/;
	my $out = $1 . ".CAZy.diamond";
	# -p表示线程数，在笔记本上用6个即可
	system("diamond blastp -d CAZy -q $_ -e 1e-5 -f 6 -o $out -k 1 --sensitive -p 30 --query-cover 50");
}

将上述代码复制到文件中，命名为“run_diamond_CAZy.pl”，将其和序列文件放在同一目录下，并在终端中输入如下命令，完成分析，得到“*.CAZy.diamond”：

1	perl run_diamond_CAZy.pl

比对结果过滤

在比对过程中我们控制了evalue和query coverage，但是没有控制identity。但是很多时候，需要设定一个identity的阈值，低于阈值的比对将会被删除，该步骤可以将比对结果拷贝到Excel中根据identity排序，手动删除阈值以下的行，然而我选择用Perl批处理。

#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
# Author: Liu hualin
# Date: Sep 30, 2021

my @cazy = glob("*.CAZy.diamond");
foreach  (@cazy) {
	$_=~/(.+).CAZy.diamond/;
	my $out = $1 . ".CAZy.diamond.filtered";
	open IN, "$_" || die;
	open OUT, ">$out" || die;
	while (<IN>) {
		chomp;
		$_=~s/[\r\n]+//g;
		my @lines = split /\t/;
		if ($lines[2] >= 40) {
			print OUT $_ . "\n";
		}
	}
	close IN;
	close OUT;
}

将上述代码复制到文件中，命名为“filter_cazy_diamond.pl”，将其和上一步产生的文件放在同一目录下，并在终端中输入如下命令，完成过滤，保留identity >= 40% 的行，得到“*.CAZy.diamond.filtered”。

1	perl filter_cazy_diamond.pl

你以为完了？还得mapping！

得到的结果如下图所示，第二列的Hits是NCBI的Assession number，我们根本只知道这是什么CAZy家族，因此需要mapping！

回头找到我们下载的cazy_data.txt，里面保存的是CAZy家族与Assession number的对应关系。比较闲的兄弟可以用查找-复制-粘贴的方法将“*.CAZy.diamond.filtered”中的Assession number替换为CAZy家族。我为比较忙的兄弟准备了下面的代码，批处理。不过我输出的是一个矩阵。

#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
# Author: Liu hualin
# Date: Sep 30, 2021

my %cazy;

open IN, "cazy_data.txt" || die;
while (<IN>) {
	chomp;
	my @lines = split /\t/;
	$cazy{$lines[2]} = $lines[0];
}
close IN;

my %hash;
my %samples;
my %ids;
my @filtered = glob("*.CAZy.diamond.filtered");
foreach  (@filtered) {
	$_=~/(.+).CAZy.diamond.filtered/;
	my $sample = $1;
	$samples{$1}++;
	open IN, "$_" || die;
	while (<IN>) {
		chomp;
		my @line = split /\t/;
		if (exists $cazy{$line[1]}) {
			$ids{$cazy{$line[1]}}++;
			$hash{$sample}{$cazy{$line[1]}}++;
		}
	}
	close IN;
}

open OUT, ">CAZy.Matrix.txt" || die;

my @samples = sort keys %samples;
my @ids = sort keys %ids;

print OUT "\t" . join("\t", @samples) . "\n";
for (my $i=0; $i<@ids ;$i++) {
	print OUT $ids[$i];
	for (my $j=0; $j<@samples ;$j++) {
		if (exists $hash{$samples[$j]}{$ids[$i]}) {
			print OUT "\t$hash{$samples[$j]}{$ids[$i]}";
		}else {
			print OUT "\t0";
		}
	}
	print OUT "\n";
}
close OUT;

将上述代码复制到文件中，命名为“assession2cazy.pl“，将其和”cazy_data.txt“，及上一步产生的文件“*.CAZy.diamond.filtered”放在同一目录下，并在终端中输入如下命令：

1	perl assession2cazy.pl

得到一个矩阵“CAZy.Matrix.txt”，内容如下，行为CAZy家族，列为基因组/样本名。拿到本文件后，可以做热图看CAZy家族在各样本中的分布情况，然而这个热图将会比鞋帮子脸还要长，可读性不高，因此我选择将这些family合并为大类，生成一个新的矩阵。

二话不说，上代码。

#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
# Author: Liu hualin
# Date: Sep 30, 2021

my %category;
my %hash;
my @samples;
my $count = 0;
open IN, "CAZy.Matrix.txt" || die;
while (<IN>) {
	$count++;
	chomp;
	if ($count == 1) {
		@samples = split;
	}else {
		my @lines = split;
		$lines[0]=~/(.+?)\d+/;
		my $cate = $1;
		$category{$cate}++;
		for (my $i=0; $i<@samples; $i++) {
			my $j = $i + 1;
			$hash{$samples[$i]}{$cate} += $lines[$j];
		}
	}
}
close IN;


open OUT, ">CAZy.Category.Matrix.txt" || die;

my @category = sort keys %category;

print OUT "\t" . join("\t", @samples) . "\n";
for (my $i=0; $i<@category ;$i++) {
	print OUT $category[$i];
	for (my $j=0; $j<@samples ;$j++) {
		if (exists $hash{$samples[$j]}{$category[$i]}) {
			print OUT "\t$hash{$samples[$j]}{$category[$i]}";
		}else {
			print OUT "\t0";
		}
	}
	print OUT "\n";
}
close OUT;

将上述代码复制到文件中，命名为“cazyfamily2categories.pl”，将其和上一步产生的文件“CAZy.Matrix.txt”放在同一目录下，并在终端中输入如下命令，得到文件“CAZy.Category.Matrix.txt”。

1	perl cazyfamily2categories.pl

接下来是要做柱状图还是heatmap，就随便了。

脚本获取

关注公众号“生信之巅”，聊天窗口回复“9052”获取下载链接。

敬告：使用文中脚本请引用本文网址，请尊重本人的劳动成果，谢谢！Notice: When you use the scripts in this article, please cite the link of this webpage. Thank you!

了尘兰若的小坑

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